Categoria
-
Resultats
Memòria de resultats del primer any de projecte
Projecte pilot innovador per part de Grups Operatius de l’Associació Europea per a la Innovació (AEI) en matèria de productivitat i sostenibilitat agrícoles.
Projecte finançat a través de l’Operació 16.01.01 (cooperació per a la innovació) del PDR de Catalunya 2014-2020.
Objectius i desenvolupament del projecte.
L’objectiu principal del projecte és incorporar noves espècies de fongs lignícoles, autòctons de Catalunya, per a diversificar el cultiu i la producció comercial de bolets comestibles.
El desenvolupament del projecte es va planificar en diferents fases i tasques, i durant el primer any (la concessió del projecte es va notificar oficialment el novembre de 2019), i d’acord amb el cronograma proposat en el projecte, s’han desenvolupat parcialment les tasques:
- Prospecció de camp en diferents ecosistemes i recol·lecció d’exemplars de diferents espècies de bolets lignícoles
- Aïllament en cultiu pur i manteniment d’una col·lecció de cultius de les espècies fúngiques recol·lectades
- Posta a punt de mètodes de producció de llavor (inòcul fúngic)
- Determinació de les condicions òptimes de cultiu de cada fong
- Proves pilot de producció en condicions industrials
Prospecció de camp en diferents ecosistemes i recol·lecció d’exemplars de diferents espècies de bolets lignícoles
S’han realitzat dues campanyes de recol·lecció en camp en les que han intervingut directament membres i col·laboradors de la Societat Catalana de Micologia, Bolets de Soca i Bolet Ben Fet. Al llarg d’aquest primer any s’han fet arribar, als laboratoris de l’IRTA i la UB, 33 enviaments amb exemplars recollits a camp de fins a 11 espècies fúngiques diferents.
Les espècies recollides fins a la data es llisten en la Taula 1. Representen quasi el 50% de les especies inicialment candidates en la proposta de projecte. Comptem amb una darrera campanya de tardor, abans de la finalització del projecte, per a poder augmentar la llista d’espècies recol·lectades en camp.
A més d’aquestes espècies, també s’han recol·lectat exemplars de Ganoderma spp. i Infundibulicybe geotropa, no incloses en la llista inicial d’espècies lignícoles candidates, però que, per les seves característiques s’han considerat interessants des d’altres punts de vista (propietats medicinals per exemple).
Taula 1.
Llistat de les espècies fúngiques lignícoles recollides a camp durant el primer any de projecte.
| Nom científic | Nom comú |
| Agrocybe aegerita | Pollancró |
| Albatrellus pes-caprae | Sabatera |
| Auricularia sp. | |
| Fistulina hepatica | Fetge de vaca |
| Grifola frondosa | Gírgola de castanyer |
| Laetiporus sulphureus | Gírgola de garrover |
| Lyophyllum decastes | Gírgola de bruc |
| Meripilus giganteus | Sabatera de faig |
| Polyporus squamosus | Bolet de noguer |
| Sparassis crispa | Greixa, Peu de rata reina |
| Volvariella sp. |
Aïllament en cultiu pur i manteniment d’una col·lecció de cultius de les espècies fúngiques recol·lectades.
A partir dels exemplars recollits a camp es va procedir a l’aïllament en cultiu pur en medis de laboratori utilitzant agar extracte de malta (MEA) suplementat amb antibiòtics. Els aïllaments es feien a partir dels teixits interns dels esporocarps de les diferents espècies fúngiques, sembrant-los en plaques Petri amb el medi de cultiu (Fig. 1), i s’incubaven a 23ºC durant el temps necessari (de 7 a 21 dies segons l’espècie). Les colònies obtingudes en ressembraven en MEA fins a garantir l’absència de contaminants.
Dels micelis obtinguts en aquests aïllaments es feia una extracció d’ADN (emprant DNeasy Plant Mini Kit de QIAGEN) i s’amplificava per PCR utilitzant els encebadors ITS1F i ITS4. Els amplicons obtinguts es van seqüenciar al Servei Científico Tècnic de la UB, i les seqüencies obtingudes es comparaven amb les dipositades a la base de dades UNITE per a corroborar l’espècie fúngica i descartar contaminants no desitjats.
Fins a la data s’han obtingut una setantena de soques fúngiques pertanyents a 9 espècies lignícoles comestibles (Taula 2). Els número de soques per espècie es desigual, i depèn de la facilitat en que s’han trobat exemplars de camp, i la facilitat d’obtenir el seu creixement en cultiu pur amb els medis de laboratori emprats. Així, d’algunes especies com Agrocybe aegerita o Lyophyllum decastes disposem d’un bon numero de soques, mentre que amb altres, com Sparassis crispa o Grifola frondosa és encara reduït.
Les soques obtingudes en cultiu pur es mantenen en la col·lecció per ressembra periòdica (cada tres mesos) en plaques de medi de cultiu fresc. Un cop crescudes a 23ºC es conserven fins a la següent ressembra a 4ºC. Aquest banc de soques fúngiques és el que s’utilitza per a la producció d’inòculs i la realització de tots els experiments del projecte.
Figura 1. Fragments de la part interna d’un esporocarp fúngic sembrats, en condicions asèptiques, en plaques Petri amb medi de cultiu agar extracte de malta suplementat amb antibiòtics.
Taula 2. Soques de fongs lignícoles disponibles en la col·lecció de cultius.
| Espècie fúngica |
Nº total d’aïllaments disponibles
(octubre 2020) |
Nº d’aïllaments confirmats
(seqüenciació ITS) |
| Agrocybe aegerita | 15 | 14 |
| Fistulina hepatica | 10 | 9 |
| Grifola frondosa | 3 | 3 |
| Laetiporus sulphureus | 11 | 11 |
| Lyophyllum decastes | 20 | 10* |
| Meripilus giganteus | 6 | 2 |
| Polyporus squamosus | 6 | 2 |
| Sparassis crispa | 4 | 3 |
| Volvariella caesiotincta | 1 | 1 * |
| Total | 76 |
Posta a punt de mètodes de producció de llavor (inòcul fúngic)
Pera al cultiu dels bolets es parteix d’un inòcul inicial que consisteix en miceli del fong crescut en una matriu que li proporciona els nutrients necessaris. Generalment s’utilitza gra de cereals per a construir aquesta matriu, ja que aporten els nutrients necessaris i son adients des del punt de vista econòmic i de manipulació.
Es va realitzar un assaig previ per a determinar la capacitat de creixement de diferents aïllats de fongs lignícoles en diferents tipus de cereals. Es va dissenyar un experiment factorial en el que es va comparar el creixement del miceli, mesurant l’avens en longitud de les hifes del fong en un tub d’assaig omplert amb gra de cada un dels cereals, prèviament rehidratats i esterilitzats (120ºC, 20 min). Es van comparar quatre especies fúngiques: Agrocybe aegerita, Fistulina hepàtica, Laetiporus sulphureus i Polyporus squamosus, en quatre cereals diferents: Blat, Sègol, Melca i Mill, prèviament sotmesos, o no, a ebullició (100ºC, 20 min).
Els resultats d’aquest assaig preliminar van permetre dissenyar una barreja de gra de blat, sègol i melca, amb un contingut d’aigua ajustat al 60% i esterilitzada a l’autoclau (120ºC, 60 min), sense necessitat de pretractament d’ebullició, com a la matriu més idònia al permetre el creixement de totes les soques testades, i oferir la facilitat de manipulació necessària per a utilitzar-la en la inoculació (o sembra) del substrats de cultiu.
El mètode de producció de llavor desenvolupat s’ha provat amb èxit amb 49 soques diferents de 8 espècies fúngiques (Fig. 2, Taula 3). S’ha testat la viabilitat de la llavor produïda iniciant amb ella assajos de cultiu de bolets a petita escala.
|
Figura 2.
Ampolles de llavor (inòcul fúngic) creixent a la incubadora a 23ºC, a diferents temps i nivells de creixement. |
Taula 3.
Espècies fúngiques, i nombre de soques de cada espècie, amb les que, fins el moment actual de desenvolupament del projecte, s’ha aconseguit produir inòcul (llavor) viable amb el mètode desenvolupat. |
||||||||||||||||||
|
Determinació de les condicions òptimes de cultiu de cada fong
Amb totes les soques amb les que es va aconseguir una producció de llavor viable (Taula 3) s’han establert assajos a petita escala, entre 8 i 10 unitats de cultiu, per determinar les possibilitats de cultiu en condicions estàndard (Fig. 3).
Fins al moment actual la totalitat dels assajos s’han dut a terme emprant un substrat a base de serradures de frondoses (en particular castanyer) suplementats amb cereals. S’han assajat diferents condicions, especialment temperatura i durada de la incubació, en càmeres de cultiu a l’IRTA (Centre de Cabrils) i a Bolet ben Fet, amb temperatura i il·luminació controlades. El desenvolupament del miceli de les diferents espècies i soques en aquets assajos s’ha valorat visualment.
|
Figura 3
Bosses de cultiu en les càmeres d’incubació amb temperatura i il·luminació controlades. Els cultius es mantenien en incubació diferents temps en funció de la velocitat de creixement de cada espècie.
|
Taula 4
Espècies fúngiques, i número de soques de cada espècie, amb les que s’han fet assajos de creixement en substrat de cultiu durant el primer any de projecte. |
||||||||||||||||||
|
Fins a la data actual s’han fet assajos de creixement en substrat de cultiu amb diferents soques de 8 espècies fúngiques. Amb la majoria d’elles s’han aconseguit bons creixements micelials (Taula 4), especialment amb espècies com Agrocybe aegerita, Laetiporus sulphureus, Meripilus giganteus o Polyporus squamosus. Altres especies, com Fistulina hepàtica i Saparssis crispa, presenten menor desenvolupament micelial en els substrats assajats, tot i que amb resultats finals diferents. Amb Lyophyllum decastes, malgrat presentar en bon creixement en la matriu de llavors, i aconseguir un inòcul ben desenvolupat, no aconseguirem que creixés en el substrat estàndard de cultiu.
Un cop assolit el creixement del miceli en tot el volum dels substrat de la bossa, les unitats de cultiu es traslladaven a les instal·lacions de Bolet ben Fet i Bolets de Soca per a prosseguir el procés en les càmeres de floració (Fig 4).
En aquestes càmeres es sotmetien a un canvi de condicions de cultiu, bàsicament disminuint la temperatura i augmentant la humitat ambiental, per a induir la producció d’esporocarps (estructures reproductives dels fongs) i completar així el cicle del cultiu obtenint els bolets comestibles.
Figura 4
Càmeres de floració a l’empresa Bolet ben Fet. El canvi de condicions, disminució de la temperatura i augment de la humitat ambiental, indueixen la formació de primordis i el desenvolupament dels bolets.
Figura 5.
Floració (producció de bolets) en bosses de cultiu de Polyporus squamosus (esquerra) i Agrocybe aegerita (dreta) a les instal·lacions de Bolet ben Fet.
Els resultats obtinguts amb cada una de les especies assajades han estat els següents:
- Agrocybe aegerita – Presenta un bon creixement en el substrats de cultiu estàndard (fusta de castanyer suplementat amb cereals). El període d’incubació en les condicions assajades (temperatura de 21±2 ºC) oscil·la entre 5 i 7 setmanes. S’ha aconseguit la producció de bolets amb tres de les soques assajades (Fig 5 dreta; Fig 6). Les produccions oscil·len entre 1 i 2,5 kg per lot (8 unitats de cultiu). Actualment s’estan assajant 9 soques més d’aquesta espècie.
- Fistulina hepàtica – El creixement del miceli en el substrat de cultiu estàndard no és total en tot el volum de la matriu. Malgrat això, el fong es desenvolupa lo suficient com per arribar a la producció de bolets. De fet, el desenvolupament de primordis s’inicia abans de sotmetre’l al canvi de condicions en la sala de floració i la incubació no es pot allargar a més de 4 o 6 setmanes. Al quedar parts del substrat sense colonitzar pel fong inoculat es facilita l’aparició de contaminants (tipus Trichoderma) en la sala de floració. S’han aconseguit bolets amb 4 de les soques assajades (Fig 7). Les produccions oscil·len entre 0,25 i 0,50 kg per lot. Actualment s’estan assajant 4 soques més.
- Grifola frondosa – Presenta un bon creixement en el substrat de cultiu. No obstant cap de les tres soques utilitzades fins el moment han arribat a la producció de bolets en condicions que es puguin considerar comercials. Una d’elles va arribar a florir despès d’un període de cultiu de 6 mesos, excessivament llarg per considerar-ho pràctic a nivell industrial. Es provaran més soques en un futur, ja que tot i ser una espècie ja cultivada interessaria aconseguir un soca autòctona.
- Laetiporus sulphureus – Aconsegueix un ràpid i bon creixement en el substrat de cultiu. S’han provat diferents soques i el creixement de miceli en les bosses de cultius és més que suficient com per esperar la formació de primordis, però amb cap d’elles hem arribat a la producció de bolets. En futurs assajos introduirem modificacions (canvi de substrat, augment del volum de les unitats de cultiu) per acabar d’establir el mètode de cultiu.
- Lyophyllun decastes – Tot i haver arribat a obtenir una bona llavor (inòcul) amb un bon nombre de soques diferents (taula 3) no s’ha aconseguit que creixi en el substrat de cultiu estàndard. En futurs assajos es provaran altres substrats.
- Meripilus giganteus – S’han aconseguit bons resultats, tant en producció d’inòcul com en obtenció de bolets en cultiu amb les 4 soques assajades (Fig. 8). Aquest fong ha mostrat un ràpid creixement amb incubacions de 4 a 6 setmanes. Les produccions oscil·len entre 1,4 i 1,8 kg per lot.
- Polyporus squamosus – És un altre de les espècies amb les que s’han aconseguit bons resultats tant en producció de llavor com en la obtenció de bolets cultivats (Fig. 9). Les dues soques assajades han fructificat en les condicions de cultiu emprades, amb produccions que oscil·laven entre 1,75 i 2,00 kg per lot.
- Sparassis crispa – S’han aconseguit bons resultats en la producció de llavor (inòcul) i presenta creixements acceptables en el substrat estàndard i les condicions de cultiu assajades, però cap de les soques ha arribat a la producció de bolets, tot i que en alguns casos s’ha observat l’inici de primordis. Es provarà, en futurs assajos, un canvi de substrat utilitzant fusta de coníferes.
Figura 6.
Bolets d’Agrocybe aegerita obtinguts en cultiu.
Figura 7.
Bolets de Fistulina hepàtica obtinguts en cultiu.
Figura 8.
Bolets de Meripilus giganteus obtinguts en cultiu.
Figura 9.
Bolets de Polyporus squamosus obtinguts en cultiu
Proves pilot de producció en condicions industrials.
Un cop establerts els sistemes de producció de llavor viable i les condicions de cultiu s’ha passat a la fase de producció de bolets, en condicions industrials, amb les tres especies que han donat els millors resultats fins aquest moment: Agrocibe aegerita, Meripilus giganteus i Polyporus squamosus.
Para a cada una de les espècies es va triar la soca que havia donat una millor producció i facilitat de maneig.
Es van preparar un total de 15 kg de llavor per a cada una de les espècies fúngiques, inoculada i incubada a les instal·lacions de l’IRTA (Fig. 10), i es van enviar a Bolet ben Fet per a que iniciessin la producció seguin els seus mètodes estàndard i a escala industrial.
|
Figura 10.
Producció de llavor a escala industrial de les tres espècies que han superat totes les fases experimentals (disponibilitat d’un cultiui pur, producció d’inòcul viable, ajust de les condicions de cultiu i producció de bolets): Agrocybe aegerita, Meripilus giganteus i Polyporus squamosus.
Amb aquesta llavor s’estan desenvolupant proves pilot a nivell industrial per a la producció de bolets. |
Aquests proves pilot estan actualment en curs.
Contribució del projecte a l’objectiu de l’AEI
Aquest projecte es va plantejar des de un inici per incorporar noves espècies fúngiques autòctones de Catalunya al conjunt de bolets comestibles cultivats. L’objectiu és incrementar i diversificar l’actual oferta en el mercat cap a nous productes amb més arrelament local.
En el moment actual de desenvolupament del projecte ja estem molt a prop de disposar de quatre noves espècies fúngiques: Agrocybe aegerita, Fistulina hepàtica, Meripilus giganteus i Polyporus squamosus, reconegudes com a comestibles en determinades zones del territori català, i que fins avui, o no eren cultivades i només s’obtenien de la recol·lecció a bosc, o, com en el cas d’Agrocybe aegerita, les soques cultivades provenien d’altres països.
A més d’aquestes especies, de les que amb tres d’elles ja s’estan fent probes pilot de producció a nivell industrial, altres especies com Laetiporus sulphureus o Sparassis crispa, han superar les primeres fases, i estem en el punt d’aconseguir bons creixements en els substrat de cultiu, però sense haver aconseguit encara la formació de bolets. Durant el segon any de projecte s’introduiran modificacions en el procés de cultiu, especialment en la composició del substrat, per arribar a obtenir la producció esperada.
Amb Grifola frondosa, espècie que ja es cultiva i que per tant té clarament definides les condicions de cultiu, s’han obtingut resultats molt limitats fins el moment. La obtenció de fructificacions ha estat molt erràtica, i anecdòtica en el nombre de bolets aconseguits. Durant el segon any de projecte incorporarem noves soques d’aquesta espècie per tal de millorar els resultat i aconseguir el que busquem, soques autòctones que donin bons resultats.
Els substrats que s’utilitzen en el cultiu d’aquests fongs s’obtenen dels residus no alimentaris produïts per l’activitat forestal i agrícola, incrementant el seu aprofitament i reciclatge. La majoria d’espècies es cultiven en substrats en els que s’utilitzen, com a component principal, residus de fusta de frondoses (castanyer, alzina, roure). Algunes de les especies que estem incorporant necessitaran la modificació d’aquests substrats, utilitzant residus d’altres fustes, com les coníferes en el cas de Sparassis crispa. L’aprofitament i reciclatge d’aquests residus es podrà ampliar a altes material i orígens de fusta fins ara poc utilitzats.
La incorporació d’aquestes espècies fúngiques productores de bolets comestibles a un sistema de cultiu agronòmic reduirà la pressió recol·lectora sobre les poblacions naturals, disminuint l’impacte ambiental d’aquesta recol·lecció i preservant la biodiversitat i el paper que juguen aquests fongs en els cicles biogeoquímics dels ecosistemes naturals.